衣藻转基因体系的构建及添加不同碳氮源对衣藻生长影响的研究.pdf

上海师范大学
硕士学位论文
衣藻转基因体系的构建及添加不同碳氮源对衣藻生长影响的研
究
姓名:刘晓磊
申请学位级别:硕士
专业:水生生物学
指导教师:王全喜;吴双秀
20080401
摘要论文题目:衣藻转基因体系的构建及添加不同碳氮源对衣藻生长影响的研究学科专业:水生生物学学位申请人:刘晓磊指导老师:王全喜教授吴双秀副教授衣藻是一种可以进行光合放氧作用的真核生物。它具有结构简单,培养成本低,绝大多数不含毒素、营养丰富、分布广泛、环境适应能力强、便于外源基因转化等优点,这些优点已经使衣藻成为比大肠杆菌和酵母等更为理想的基因工程宿主;而且随着衣藻基因工程的发展,已有一批有应用前景的外源基因得到成功表达,使转基因衣藻可以在医药和环保问题上得到应用。转基因衣藻可以通过两种方式获得,即衣藻的叶绿体转化和衣藻的核转化。衣藻的叶绿体转化,通过同源重组方式将外源基因置换到衣藻叶绿体上,因此具有位点专一的同源重组、异源基因高效表达、母系遗传等优点,因此以衣藻叶绿体作为转化受体表达异源基因成为转基因工程研究中的又一热点课题。衣藻的核转化是通过外源基因随机非同源整合方式整合到衣藻核染色体中,所以又可利用核转化产生的插入诱变来进行必要基因或非必要基因的功能研究。本论文主要构建带有豆血红蛋白基因的衣藻叶绿体转化载体,可以尝试将此豆血红蛋白基因导入衣藻叶绿体中表达,在不影响衣藻正常生理代谢的情况下,以期望得到的转基因衣藻较之野生藻的氢气产量有所提高。在本实验室内通过衣藻核转化体系来进行高活性产氢酶的转基因衣藻的筛选;同时检测添加不同浓度碳源及氮源对野生型衣藻生长状态的影响,特别是在暗培养条件下衣藻的生长状态,为优化野生型衣藻产氢培养条件做一些基础工作。①通过基因工程手段改造衣藻叶绿体转化载体,将其载体中所存在的单一多克隆酶切位点移动到衣藻强启动子与调控基因疷之间,并将改造好的载体②通过基因工程手段改造衣藻叶绿体转化载体湓靥逯兴嬖诘淖彻勖素表达盒的终止子去掉,实现外源基因与基因能够串联表达,将改造好的载⑧从大豆总锌寺〕隽硕寡:斓鞍谆騆、彻勖顾乇泶锖本论文的主要内容及结果如下:命名为体命名为籣基因经双酶切切下,把己克隆出的豆血红蛋白基因插入剑膒舳拥
籎,的筇地启动子与壮观霉素表达盒讶ブ罩棺的下游,成功构建了穿下游,成功构建了穿梭表达载体.、甃瓤衫没枪进行衣藻光合基因突变株的互补实验。④从大豆总锌寺〕隽硕寡:斓鞍谆騆、、海洳迦氲皆靥梭表达载体、—,既可利用玻璃珠法或基因枪法进行衣藻叶绿体转化实验。⑤利用香港科技大学所赠的适用于衣藻核转化的质粒幸略搴转化,构建衣藻核转化体系,为大量筛选高产氢酶活性的衣藻突变株打下前期基础,通过抗生素筛选及继代培养,获得大量核转化突变株,并且对转基因衣藻进行了平的检测,通过椒ǎ舛酥柿己成功转化到衣藻中。⑥添加不同浓度的碳源和氮源在无光照条件下訮幸种,对于衣藻生长状态的影响,即优化衣藻暗培养培养条件。在本实验设置范围内,~,尿素的最适添加量为甃一,..阅蛩氐淖楹希俏蠢吹牟祷嘌节约成本的角度出发,葡萄糖为对衣藻生长促进最大的外源物质,最适添加量选为以上结果表明,构建好的含有豆血红蛋白基因的表达载体可以进行衣藻叶绿体转化实验;并建立了衣藻核转化体系,得到一系列核转化突变株;优化了衣藻产氢培养的条件,得到了本实验室实验设置范围内最适培养条件;为以后进行衣藻叶绿体转基因体系的建立、得到高产氢酶活性的转基因衣藻及最优化衣藻产氢培养条件做一些基础工作。关键词:衣藻基因工程;豆血红蛋白基因;衣藻叶绿体转化;衣藻核转化;转基因衣藻;
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⒄,得益于化石能源,如石油、天然气、煤炭与核裂变能的广泛的投入应用,因而它是建筑在化石能源基础之上的一种经济;然而,由于这一经济的资源载体将在世纪上半叶迅速地接近枯竭,因此在全世界范围内形成能源危机。主要表现在以下几方面:①能源消耗的速度自本世纪年代以来,随着工农业生产的迅速发展和交通工具数量的增加,世界能源消耗速度急剧增加,尤其是发达越来越高,造成发达国家能耗很大。②能源消耗