ERCC1的表达纯化及其单克隆抗体的制备.doc

1的表达纯化及其单克隆抗体的制备
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:李晓杰, 蒋华, 高慧萍, 姚晓, 石必枝李宗海
【摘要】目的: 1蛋白并制备其单克隆抗体(mAb)。方法: 1蛋白, 其氨基端带有6His标签。纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠, 经融合、筛选制备特异性mAb。结果: 1蛋白。SDSPAGE显示所表达蛋白的相对分子质量(Mr)约为37 000。获得了1 1抗体的杂交瘤细胞株(6F8), 其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG2b。ELISA检测, 对应腹水mAb的效价为1∶×106。Western 1 mAb具有良好的特异性。结论: 1 mAb。
【关键词】 1; 原核表达; 纯化; 单克隆抗体
核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)是哺乳动物细胞DNA 修复的主要途径; 切除修复交叉互补基因(excision repair plementing 1, 1)在核苷酸切除修复过程中起着关键作用。最近, 很多研究表明它的表达与肺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤对铂类药物的敏感性有密切关系[1-3], 其表达有望作为铂类用药的分子标记。但是迄今为止, 国内尚无制备其单克隆抗体(mAb)的报道。1蛋白并制备了其mAb, 1奠定基础。
1 材料和方法
材料 pET
28a(+)载体、大肠杆菌BL21(DE3)、骨髓细胞系Sp2/0、 A431细胞系由本实验室保存。骨髓细胞系Sp2/0以DMEM、 100 mL/L小牛血清, 在37℃、 50 mL/L CO2条件下培养。A431以DMEM、 100 mL/L胎牛血清, 在37℃、 50 mL/L CO2条件下培养。弗氏完全佐剂及不完全佐剂购自Sigma Aldrich。胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。GAPDH抗体购自康成生物技术有限公司。HRP标记的羊抗鼠二抗由本实验室制备。其他试剂均为国产分析纯。BALB/c小鼠由本研究所实验病理室提供。
方法
载体构建及鉴定以人胎盘 cDNA为模板, 1基因的特异引物进行PCR扩增。上游引物ECF为: 5′TGGGAAGGACAAAGAG3′(划线处为Nde Ⅰ酶切位点); 下游引物ECR为: 5′CCCAAGCTTTCAGGGTACTTTCAAGAAGGGCTCG3′(划线处为Hind Ⅲ酶切位点)。以KOD plus DNA 聚合酶(ToYoBo)PCR扩增, 反应的条件为: 94℃ 3 min, 然后进行30个循环: 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 68℃ 50 s, 最后68℃延伸10 min。PCR产物纯化回收, 用Nde
Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切, 同时用NdeⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切pET28a(+) 载体质粒, 在T4 DNA连接酶作用下, 构建重组表达载体pET28a(+)1。
1蛋白的表达及纯化及复性用pET28a(+)1转化大肠杆菌BL21(DE3)。挑取单克隆接种于含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中, 37℃震荡培养过夜, 按1∶100转接, 37℃, mm