考马斯亮蓝及考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程.doc

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考马斯蓝染色
手上沾到了考马斯亮蓝?
Coomassie brilliant blue G-250
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考马斯蓝染色
coomassie blue staining
又称Bradford法,由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。
考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不适用于小分***性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m1 95%乙醇,加入100ml浓磷酸,然后,用蒸馏水补充至200ml,此染液放4℃至少6个月保持稳定。
:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品