标准的PCR反应体系.doc

标准的PCR反应体系PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系: 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物各200umolL 引物各10~100mol 模板DNA 01~2ug TqDNA聚合酶 25u g2+ 15mmolL 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+ 引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则:①引物长度:15-30b,常用为20b左右。②引物扩增跨度:以200-500b为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度01~1umol或10~100mol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1NH或1Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到70~75,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umolL,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与g2+结合,使游离的g2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与***仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫***酸胍或蛋白酶K法,要防止RNse降解RNA。 g2+浓度 g2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umolL时,g2+浓度为15~20mmolL为宜。g2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TqDNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300b时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度TqDNA酶仍有较高的催化活性)。①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。②退火(复性)温度与时间:退火温度是影