实验一 质粒DNA的提取.doc

一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。二、方法挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌,接在含有100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基(5ml/15ml试管)中,37℃震摇培养过夜。,14000r/min,离心10秒,其取上清液。反复数次,收集全部菌体。倾去上清,滤纸吸干。加30μlTE缓冲液(10mmol/LTris—HCl,1mmol/LEDTA,),振荡起菌体。加30μlTENS溶液(10mmol/LTris—HCl,,1mmol/LEDTA,,%SDS),震荡10秒至溶液变粘稠。,震荡3—5S,14000r/min,离心3分钟,沉淀细胞碎片及染色体DNA。上清液转移至另一微离心管中,甲等体积胞和酚,混匀,12000r/min,离心2分钟。上层水相转移至另一位离心管,加2倍量冷水乙醇,14000r/min,离心20分钟。,加入7o%冷乙醇淋洗。,滤纸吸于,真空抽吸2~3分钟。,溶解DNA。12,加入1μl核糖核酸酶(10mg/m1),14000r/min,离心2s,使核糖核酸酶与管底液体混匀。℃水浴30min。℃冰箱保存备用。三、(10mmol/LTris—HCl,1mmol/LEDTA,)配制方法:,,加重蒸水定容至1000ml。:(10mmol/LTris—HCl,,1mmol/LEDTA,,%SDS)配制方法:。()配制方法:,,加重蒸水定容至100ml。纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红色或黄色结晶体,使用之前必须重蒸,除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解,重新进行蒸馏,当温度升至183℃时,开始收集在若干个棕色瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取一瓶重蒸酚于分液漏斗中,加入等体积的lmol/LTris-HCI()缓冲液,立即加盖,激烈振荡,并加入固体Tris摇匀调pH(一般100ml苯酚约加l克固体Tris)。从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中,-HCI()