还原糖和总糖含量的测定(3 ，5 一二硝基水杨酸比色法).doc

还原糖和总糖含量的测定( 3,5 一二硝基水杨酸比色法) 作者:佚名文章来源: 生物化学实验技术点击数: 2132 更新时间: 2006-5-13 11:29:24 一、目的植物体内的还原糖,主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布,不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况,而且也是呼吸作用的基质。还原糖还能形成其他物质如有机酸等。此外,水果蔬菜中糖量的多少,也是坚定其品质的重要指标。还原糖在有机体的代谢中起着重要的作用,其他碳水化合物,如淀粉蔗糖等,经水解也生成还原糖。通过本实验,掌握还原糖定量测定的基本原理,练****比色定糖法的基本操作,热悉分光光度计的使用方法。二、原理各种单糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同,可以植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。在碱性条件下,还原糖与 3,5一二硝基水杨酸共热, 3,5一二硝基水杨酸被还原为 3- 氨基-5- 硝基水杨酸(棕红色物质),还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系, 540nm 波长下测定棕红色物质的消光值,查对标准曲线并计算,便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。三、仪器、试剂和材料 (1)刻度试管: 25 mlX 11 (2)离心管或玻璃漏斗 X2 (3)烧杯: 1OOml X1 (4)三角瓶: 100m1 X1 (5)容量瓶: 100ml X3 (6)刻度吸管: 1 mlX1, 2m1 X 4, 10ml X1 (7)恒温水浴(8)沸水浴(9)离心机(过滤法不用此设备) ( 10)电子顶载天平( 11)分光光度计 (1)1 mg/ ml葡萄糖标准液:准确称取 100mg 分析纯葡萄糖(预先在 80℃烘至恒重),置于小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,定量转移到 100ml 的容量瓶中,以馏水定容至刻度,摇匀,冰箱中保存备用。(2)3, 5-二硝基水杨酸试剂:将 3, 5-硝基水杨酸和 262ml 2mol/NaOH 溶液,加到 500ml 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中,再加 5g结晶酚和 5g亚硫酸钠,搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至 1000ml ,贮于棕色瓶中备用。(3)碘-碘化钾溶液:称取 5g碘和 10g 碘化钾,溶于 100 ml蒸馏水中。(4)酚酞指示剂:称取 酚酞,溶于 250ml 70%乙醇中。(5) 6mol /L HCl 。(6) 6mol/L NaOH 。 。四、操作步骤 25ml 刻度试管,编号,按下表操作。将各管摇匀,在沸水浴中加热 5min ,取出后立即冷却至室温,再以蒸馏水定容至 25ml ,混匀。在 540nm 波长下,用 0号管调零,分别读取 1-6 号管的吸光度。以吸光度为纵坐标,葡萄糖毫克数为横坐标,绘制标准曲线。 (1)样品中还原糖的提取:准确称取 3g食用面粉,放在 100ml 三角瓶中,先以少量蒸馏水调成糊状, 然后加 50ml 蒸馏水,搅匀,置于 50℃恒温水浴中保温 20min ,使还原糖浸出。离心或过滤,用 ZOml 蒸馏水洗残渣,再离心或过滤,将两次离心的上清液或滤液全