苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3aa在虫生真菌孢白僵菌中的表达.pdf

安徽农业大学
硕士学位论文
苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因Vip3Aa在虫生真菌孢白僵
菌中的表达
姓名：任小芳
申请学位级别：硕士
专业：微生物学
指导教师：李增智;黄勃
2011-06
摘要

球孢白僵菌作为最为常见的虫生真菌，寄主范围广，且易于大量生产，在自然环
境中有时能在寄主种群中形成流行病，有利于抑制虫口的大发生。但由于其对害虫的
致死时间较长、对环境条件要求又高，所以球孢白僵菌杀虫剂应用的广泛性受到限制。
利用基因工程技术提高菌株毒力是当今世界上关注的研究热点。本文以球孢白僵菌
Bb13 和 Bb1944 作为出发菌株，分别引入苏云金杆菌的营养期杀虫蛋白基因 Vip3Aa，
构建了两个转基因工程菌株。
根据苏云金杆菌营养期杀虫蛋白基因 Vip3Aa 序列设计全基因扩增引物，并在引
物两端添加合适的酶切位点 EcoRI 和 XhoI，对目的基因进行 PCR 扩增，将纯化的
PCR 产物和含有筛选标记 bar 基因的载体 pbarGPE1 质粒分别进行 XhoI 和 EcoRI 双
酶切，再次纯化，然后，将两者的纯化物进行连接，构建成真菌表达载体
pbarGPE1-vip3Aa。将构建好的质粒经 ScaI 酶切线性化后，利用芽生孢子转化法转入
虫生真菌球孢白僵菌 Bb13 和 Bb1944 菌株内，得到白僵菌工程菌株 Bb13V 和
Bb1944V。RT-PCR 结果证明 Vip3Aa 在两个工程菌株中均能得到成功转录。
在室内恒温 25℃ 条件下，用喂食、喷雾以及两者相结合的方法，分别测定
1×105 、1×106 、1×107 、1×108 和 2×108孢子/ml五个不同孢子浓度下Bb13 和Bb1944
的原始菌株和工程菌株对二龄马尾松毛虫和玉米螟的毒力，将测定结果用DPS进行数
据分析。
对松毛虫测定的结果表明，在 2×108孢子/ml孢子浓度下，工程菌株和非工程菌株
间致死率差异不大。在 1×105 、1×106 、1×107 和 1×108孢子/ml四个不同孢子浓度下
处理条件下，采取 3 种不同的处理方式，工程菌株均原始菌株致死率提高 30%以上；
喷雾处理的毒力提高 ~ 倍；喂食处理组的致死率均高于喷雾处理。在所有处
理中，喂食和喷雾相结合的处理组致死率最高。在 1×108孢子/ml浓度下，喂食处理的
致死率显著高于喷雾处理，致死中时缩短 。
对玉米螟测定的结果表明，工程菌株各处理组均比原始菌株的死亡率高；喷雾处
理的毒力提高了 ~ 倍；在 2×108孢子/ml浓度下，喷雾组的致死中时（）
比原始菌株（）缩短了 。
两个菌株的毒力测定都说明 Vip3Aa 基因在转入白僵菌后得到了表达，使得工程
菌对松毛虫和玉米螟的毒力明显增强。

关键词：球孢白僵菌，Vip3Aa基因，载体构建，毒力测定

I
Abstract

Beauveria bassiana is one of the most common entomogenous fungi, with wide
host range and great convenience for massp