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核酸提取及常见问题分析
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、
　　　　　原因分析及其对策
内容
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见
机溶剂抽提法：
　　　　
　
　密度梯度离心法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
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质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
变性染色体DN***段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。
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质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体
溶液III中和
溶液I充分重悬
溶液II裂解
上清液
抽提
离心洗涤
酒精沉淀
干燥溶解
沉淀
质粒DNA溶液
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质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；
变性染色体DN***段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。
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细胞器DNA－差速离心法
差速离心法原理
是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
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第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、
　　　　　原因分析及其对策
内容
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见
问题、原因分析及其对策
第二部分：DNA提取常见问题、
　　　　　原因分析及其对策
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DNA提取的基本步骤

－内容物释放
、纯化
，并去除杂质
 

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材料准备
最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融
提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）
组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解
含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）
培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失
尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量
菌株不要频繁转接（质粒丢失）
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细胞裂解
材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低
针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
植物材料－－液氮研磨
动物组织－－匀浆或液氮研磨
组培细胞－－蛋白酶K
细菌－－溶菌酶破壁
酵母－－破壁酶或玻璃珠
高温温浴时，定时轻柔振荡
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
菌体量适当
培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮
变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断
复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染
G＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁
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核酸分离、纯化
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系
采用有机（酚/***仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔
离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
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核酸分离、纯化
蛋白质的去除：
酚/***仿抽提
使用变性剂变性（SDS、异硫***酸胍等）
高盐洗涤
蛋白酶处理
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多糖的去除：
高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
用多糖水解酶将多糖降解。
在提取缓冲液中加一定量的***苯(1/2体积)，***苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。
用PEG8