角膜缘干细胞体外培养的研究进展.doc

1 角膜缘干细胞体外培养的研究进展【关键词】角膜缘;干细胞;体外培养;眼损伤角膜上皮细胞具有自我更新的能力,眼表的正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成。随着眼表疾病研究有突破性进展, 角膜缘干细胞在眼表中的重要性越来越受到人们的重视, 角膜缘干细胞体外培养的研究也日渐增多。笔者现就角膜缘干细胞的体外培养与临床应用作一综述。 1 概述角膜缘干细胞是角膜上皮增殖、分化、移行的源泉。角膜缘干细胞具有其他干细胞所具有的特殊的生物学特性, 并通过向心性移动和角膜上皮基底细胞的分裂、迁移, 来补充角膜表面脱落的上皮细胞, 完成上皮细胞的更新这一动态的平衡过程。目前认为角膜缘 Vogt 栅栏内的网状嵴上皮是角膜上皮干细胞的位置所在。 1971 年 Davanger 等[1] 提出角膜缘 Vogt 栅栏的概念并观察到此处细胞向角膜中心水平 2 移动。 1986 年 Schermer 等[2] 利用特异性 64KD 角蛋白( K3 ) 的手段,正确定位角膜缘上皮干细胞的存在。 1987 年 Ebat o 等[3] 通过比较角膜不同部位细胞在体外培养的生长情况, 也进一步证实角膜上皮干细胞位于角膜缘处。角膜缘干细胞的确定和经过不断的探索研究,发现角膜缘干细胞具有以下特点[4]:①位于角膜缘基底部, 占整个角膜上皮细胞的 % ~ 10% ;②具有水平向心运动和垂直向上运动;③增殖力高, 细胞周期长, 分化程度低, 不对称分裂;④不表达角蛋白 K3 ;⑤含有丰富的蛋白酶:α- 烯醇酶、细胞色素氧化酶、碳酸酐酶等;⑥角膜缘上皮细胞正常处于 G1 晚期, 细胞富含周期蛋白 A、D、E 和增殖细胞核心抗原。 2 角膜缘干细胞的获取和分离角膜缘干细胞的正确定位, 使获得干细胞作体外培养成为可能。 取材动物取材在全身麻醉下进行,用 1/1000 络合碘消毒眼周, 冲洗眼球后用手术刀从角膜缘切取组织块。尸体取材时, 3 在死亡后 6h 内取下眼球, 剪取角膜缘内外各 1mm 角膜缘组织, 去除多余结膜组织和基质层。用含双抗( 105u/L 青霉素加 100mg/L 链霉素) Hank 液漂洗备用。 角膜缘干细胞的分离和培养常用的分离方法有组织块直接培养、消化法及两种方法同时应用的混合法。 组织块培养法将上述组织块剪成 1mm × 1mm × 1mm 大小, 放入含少量纯胎牛血清培养瓶中密闭 2h ,缓慢加入少量培养基, 37℃, 5%CO2 , 95% 湿度孵化箱过夜,次日补加培养基。接种后 3 天首次换液, 以后隔日换液, 每日倒置显微镜观察。此法操作环节少,细胞损伤小,可减少污染机会。但培养时间长, 细胞成分复杂,常混有纤维细胞,分离和纯化较困难。 酶消化法将组织块剪成 2mm × 2mm 大小, Hank 液冲洗 2 次, 胰蛋白酶与 EDTA 1∶1 混合为消化液,用量 4 为组织量的 30~ 50 倍,消化 10~ 15min 到组织块疏松,弃去消化液。 Hank 液冲洗 2 次,消除 EDTA 消化作用,加入等量 200ml/L 胎牛血清的细胞培养液终止胰蛋白酶消化。吸出培养液后再加入新的培养液 2 次,消除残余消化作用。然后加入培养液进行吹打使细胞分散, 1000r/ ,离心 5min ,取重悬细胞以 100 × 106/L 接种量移入有孔培养板进行培养。此法可在较短时间内获得细胞进行培养和研究,但操作复杂, 对消化时间和温度的控制有较高的要求。 混合法即上述两种方法同时使用。组织块消化后所得的细胞悬液移入培养器进行培养的同时, 将组织块也一起移入同时培养。此法培养的细胞易存活, 形成膜片时间短, 获得的细胞中含有少量纤维细胞,既能增加上皮膜片的张力强度,又能起到“饲细胞”的作用,促进细胞生长,有利于细胞成膜生长进行移植研究。 3 培养基的选择角膜缘干细胞在体外培养时具有极高的增殖潜力。由于各人采用的培养基不同, 增殖力亦有所不同。目前用于角 5 膜缘干细胞的基础培养液主要有 DMEM 、 DMEM/F12 (1∶1)、 M199 、 M199/F12 (1∶1)、 PRMI-1640 等。目前大多采用 DMEM/F12 (1∶1 )及添加激素的上皮细胞培养液(SHEM) 做基本培养基,加入 10% 小牛血清, 谷氨酸***, 胰岛素, μ g/ml 氢化可的松, 10ng/ml 表皮生长因子, 腺嘌呤, 霍乱***等。但何种培养基最适于培养角膜缘干细胞,目前尚无报道。血清成分复杂, 含有一定的细胞毒性物质和抑制物质, 对细胞有去分化作用, 影响某些功能的表达