体外慢病毒介导bmp-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法.docx

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专利名称:体外慢病毒介导bmp-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法
技术领域:
:本发明涉及生物医学领域,尤其涉及一种软骨分化的方法,特别是一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法。
背景技术:
:近些年来,使用滑膜间充质干细胞进行半月板软骨修复是关节外科的热点问题。经典的组织工程学方法是将体外增殖诱导干细胞形成种子细胞,种植种子细胞在生物支架上,将支架移回生物体并添加各种细胞因子进行修复。既往许多研究者选择骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derviedmesenchymalstemcells,BMSCs)作为种子细胞。但是当DeBarii发现了滑膜间充质干细胞(synovium-derviedmesenchymalstemcells,SMSCs)后,其迅速取代了BMSCs。原因在于:尽管SMSCs在细胞形态、免疫表型、集落形成能力和分化潜能方面和BMSCs相似,但其具有更强的软骨分化潜能;此外,生理上当半月板出现损伤时,滑膜作为SMSCs的储存器,会移行定植到损伤处,和局部细胞一起,完成修复过程。所以选择SMSCs,更符合生理过程,并有更专一的软骨分化潜能。目前为止,有个案报道研究者采用转化生长因子
3(TGF-03)和骨形成蛋白2(BMP-2)作为介导SMSCs向软骨分化的诱导因子。Sakaguchii1、Shirasawaiii和HorieMiv等利用TGF-β3、BMP-2和地塞米松(Dex),成功诱导SMSCs向纤维软骨分化。但这一过程中仍存在诸多问题:诱导所需的BMP-2浓度需要非常高(50200g/L甚至更高),且时间很长,这就导致SMSCs有向骨分化的可能。且体外反复应用细胞因子存在降解失活的可能,并大大增加培养费用。所以在本发明的实验中,采用慢病毒介导兔BMP-2基因转染SMSCs,并加入EGFP基因作为报告基因,从而为应用组织工程学方法进行软骨修复提供新思路和新方法
发明内容
:本发明的目的在于提供一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法,所述的这种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法要解决现有技术中体外诱导滑膜间充质干细胞向软骨分化的方法成功率低、而且时间和成本高的技术问题。本发明提供了一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法,包括一个将滑膜间充质干细胞分离、培养的步骤,还包括一个构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤,一个制备转染慢病毒的病毒液的步骤,一个将转染慢病毒转染滑膜间充质干细胞的步骤,在所述的构建重组质粒
pFUGW-oBMP-2的步骤中,首先根据BMP-2基因设计引物,通过逆转录反应扩增BMP-2基因,将已经包含EGFP报告基因的pFUGW质粒和BMP-2基因重组,构建重组质粒pFUGW-oBMP-2,在所述的制备转染慢病毒的病毒液的步骤中,利用所述的重组质粒pFUGW-oBMP-2加上包装质粒,共同构建转染慢病毒,然后再加入缓冲液培养、孵育、移去上清、过滤后得到转染慢病毒的病毒液,在所述的将转染慢病毒转染滑膜间充质干细胞的步骤中,取第三代以上的滑膜间充质干细胞和解冻的转染慢病毒的病毒液混合,将混合物离心、培养40-52小时,然后将上述的培养物加入不完全成软骨诱导培养液诱导培养液中诱导,诱导14天以上即可获得软骨细胞。进一步的,在所述的制备转染慢病毒的病毒液的步骤中,首先扩增重组质粒pFUGW-oBMP-2、,提纯浓缩;其次将293T细胞的细胞密度调至IO7,放入培养瓶中培养,所述的培养瓶内含有DMEM培养基,所述的培养基中还包含有青霉素G、链霉素、小牛血清、聚赖氨酸,所述的青霉素G在DMEM培养基中的浓度为100U/ml、所述的链霉素在DMEM培养基中的浓度为100μg/ml、所述的小牛血清在DMEM培养基中的质量百分比浓度为10%、所述的聚赖氨酸DMEM培养基中的浓度为5%,将293T细胞于培养瓶孵育后加入含有pFUGW-oBMP-2、psPAX2、,孵育、移去上清、过滤后得到转染慢病毒的病毒液。进一步的,在所述的构建重组质粒
pFUGW-oBMP-2的步骤中,将oBMP_2的cDNA用Agel和Nhel双酶切,同时,将已经包含EGFP报告基因的pFUGW用Agel和Nhel双酶切,然后加入T4DNA反应得到pFUGW-oBMP-2重组质粒。进一步的,在扩增BMP-2基因的过程中,所述的5’端的引物序列如SEQIDNO:1所示,所述的3’端的引物序列如SEQIDN0:2所示。进一步的,所述的不完全成软骨诱导培养液培养液是一个含TGF-P3、地塞米松、2-磷酸-抗坏血酸、脯氨酸、丙氨酸、1:100稀释的ITS+Premix溶液的H-DMEM培养液;其中,在所述的H-DMEM培养液中,TGF-β3的浓度为10ng/mL、地塞米松的浓度为IXIO^mol/L、2-磷酸-抗坏血酸的浓度为50μg/mL、脯氨酸的浓度为40μg/mL、丙氨酸的浓度为lOOyg/mL、所述的1:100稀释的ITS+Premix溶液中含有胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、牛血清白蛋白、亚油酸,在所述的1:100稀释的ITS+Premix溶液中,、、、牛血清白蛋白的浓度为
、。尽管SMSCs和BMSCs在细胞形态、免疫表型、集落形成、分化潜能方面均类似,但SMSCs具有更强的软骨分化潜能,所以本发明选用SMSCs作为软骨修复的种子细胞。目前被认定可以促进SMSCs向软骨分化的细胞因子包括=TGF-P1、BMP_2、IGF-1、DEX。
TGF-βI可以增强SMSCs的扩增,并抑制其向骨和脂的分化,TGF-βI的作用机理通过ERK1/2MAPK信号通路实现的。ΒΜΡ-2被公认为最强的成骨因子。但是近年来的研究认为其亦可以诱导间充质干细胞向软骨分化。尽管目前对其机理知之甚少,但是其应用却日渐增广。但其应用过程中,仍然存在诸多问题:ΒΜΡ-2的制造工艺非常复杂,产量很低;且新陈代谢很快,诱导时间较短;且作为外来蛋白,当大量应用时可对机体产生有害作用。一些研究者尝试利用支架搭载缓释ΒΜΡ-2,但ΒΜΡ-2对材料高度敏感,当置于支架上,其活性会降低。所以为解决上述问题,采用将ΒΜΡ-2基因导入慢病毒,并转染SMSCs,从而使得BMP-2蛋白随SMSCs增殖而生成。有趣的是,在的实验结果看来,BMP-2可能是诱导SMSCs向软骨分化的关键因子。相比于其他的病毒载体,慢病毒载体不仅可以转染分裂期细胞,还可以转染非分裂期细胞。且目的基因的表达稳定、长效。EGFP,作为报告基因,可以直接被观测到。其在470nm处吸收可见光,并在510nm处发出绿色荧光。只要表达足够强烈,其可直接在活体观察。不同于其他荧光标记物,例如LacZ>Luc、β-galactosidase,其应用中无需再添加其他因子。所以,在本发明的实验中,使用了已经包含EGFP基因的pFUGW来转染SMSCs,从而使得观察变得简单明了。转染后,免疫荧光和Westernblot结果均证实有BMP-2蛋白生成。被转染后的
SMSCs,其安全性尤为重要,因为其决定了是否可以被用作种子细胞。相关的生长曲线表明细胞数量在第7天趋于稳定,表明其分化能力非无限制的。流式细胞仪被用于测定DNA含量,结果提示无假二倍体细胞,被转染的SMSCs均为正常的二倍体细胞。此外,核型分析显示SMSCs中含44条染色体。致瘤性试验表明其无致瘤性。这些结果都证实了SMSCs是安全的,可以被用作种子细胞。之后将安全的SMSCs放在不完全成软骨培养基上。发现其细胞形态从梭形细胞转为多边形细胞。通过RTPCR可检测到I型胶原、2型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达。间接免疫荧光结果亦表明有I型胶原和2型胶原生成。在正常的软骨发育不全病例中,可见MicroRNA_130a表达缺失。其在软骨形成过程中表达逐渐减少。其靶基因Runx3在软骨发育不全病例中亦表达缺失。Micro-145,作为正常关节软骨中Sox9的直接调节者,其通过结合3’-UTR的特定结合位点而下调了Sox9的表达。在人软骨表型中,Micix)-145非常重要。当其水平升高时,会降低特异性软骨细胞外基质基因(C0L2A1和聚集蛋白聚糖)和组织特异小RNA(miR-675andmiR-140)的表达,同时升高RUNX2和MMP13的表达,后两者在骨性关节炎病例中多见。所有上述的结果均显示BMP-2可诱导SMSCs向软骨分化。本发明提供了一种用于半月板修复的新的种子细胞。经plentiV6-oBMP-2转染的SMSCs足够安全,为正常的二倍体细胞,无致瘤性,且在体外可自发向软骨分化。
:图1是转染前贴壁后I天光镜下(100X)SMSCs的形态学照片,光镜显示为梭形细胞。图2是转染前贴壁后14天光镜下(100X)SMSCs的形态学照片,光镜显示为梭形细胞。图3是转染前贴壁后14天电镜SMSCs的形态学照片,电镜显示核质比大。图4是免疫荧光试验。A、B、C、D依次为为绿色荧光显示波形蛋白生成;绿色荧光显示a-SMA生成;红色荧光显示有0ct4表达;红色荧光显示有Sox9表达。图5是流式细胞仪结果。A、B、C、D、E依次为CD44(%)、CD90(%)、CD29(%)、CD34(几乎无)、CD45(几乎无)。图6是多向分化实验结果。A、B、C依次为成骨诱导、成脂诱导、成软骨诱导。可见AKP染色(+)、油红染色(+)、碱性甲苯***蓝染色显示有胞外基质GAG生成。图7显示慢病毒转染后的图;其中A为流式细胞仪显示转染率超过80%;B为对应荧光图(100X)。图8显示转染培养后细胞形态(200X)的照片。A为在不完全成软骨培养基上,细胞由梭形细胞变为多边形细胞;B为实验对照组中细胞形态几乎无变化。图9显示RT-PCR结果。实验组表达I型胶原、2型胶原等,且2型胶原更多;实验对照组少量表达I型胶原和2型胶原等;空白对照组不表达。图10显示免疫荧光染色和甲苯***蓝染色实验(200X)的照片。红色荧光显示有I型胶原生成,绿色荧光显示有2型胶原生成,实验组被甲苯***蓝染色,实验对照组和空白对照组均无染色。图
11显示MiCT0RNA分析。A为在实验组、实验对照组、完全对照组、基线组中M1-130a的表达,B为在实验组、实验对照组、完全对照组、基线组中M1-145的表达。
具体实施方式
:实施例1:SMSCs的获取、(SPF级,Slack实验动物中心,中国科学院,)(±,雌雄不限)。固定麻醉后,取館旁直切口,逐层打开至关节囊,用组织剪取髌上囊滑膜组织。将取得的滑膜剪碎,37°C下用2型胶原酶(%,Sigma-Aldrich公司,)消化3小时,经200-lm滤网(佳宝公司,)过滤后获取组织块,并培养于含20%FBS(Hyclone公司)的DMEM(GibcolBRL公司,,com/products/gibco~brl)中。上述所有过程均在超净台(Sff_CJ_lF,佳宝公司,,cn/c20931)内完成。随后保存于5%C02孵箱中(CCL-170A-8,ESCO公司,,php)中孵育14小时。随后再次剪碎、过滤后保存于含10%PBS的60mm培养皿中。每24小时换液以去除未贴壁的细胞。。基于阴性分离法原理分离
SMSCs。向细胞群中加入了含有CD14的戴诺磁珠(111-49D,DynabeadsCD14,,),随后经过磁珠分选仪(KingFisher,安诺生物科技公司,)即得到纯化的SMSCs。将这些细胞按照IOOcells/cm2的密度培养14天后冻存于_80°C下作为Pl代。。将细胞消化成悬液后,随机选取100个视野,测量所见细胞的直径。同时,还进行了电镜观察。%Trypsin/EDTA(YW003,宜滕生物公司,)消化后,%戍二醒和锇酸(帝科化工公司,,htm)固定90分钟。再用70%酒精饱和醋酸液铀染色,经酒精和***脱色后包埋于环氧树脂618中(博伟化工公司,)。随后切成90nm超薄切片,再经乙酸双氧铀和柠檬酸铅双染色后,于透射电镜(H-7650,HITACHI公司,)下镜检。结果:贴壁后2天,已经有一些梭形细胞;14天后,细胞几乎均为梭形细胞。此外,透射电镜显示核质比较大,核仁较大而细胞质却不发达(图1、2、3),符合干细胞的形态学特征。
,用4%多聚甲醛固定,然后浸入2%BSA/PBS中10分钟。一抗包含0ct4(羊抗,1:50,Sigma-Aldrich公司,)、波形蛋白和a-SMA(均来源于鼠抗,1:200,Sigma-Aldrich公司,)和Sox_2(鼠抗,1:400,Sigma-Aldrich公司,)。培养24小时后,加入二抗,二抗包含FITC-羊抗鼠IgG(1:100,Sigma-Aldrich公司,)、Cy3_羊抗鼠IgG和Cy3_驴抗羊IgG(均为1:150,KPL公司,)ο随后DAPI染色观察。结果:免疫荧光分析显示P3代细胞表达了波形蛋白和a-SMA,此二者为SMSCs的细胞表面标志物。此外,0ct4和Sox2表达也很强烈(图4),尤其是0ct4,表明细胞有多向分化潜能。所以可以认为P3代细胞基本都为间充质干细胞了,并且有多向分化潜能。%Trypsin/EDTA消化。随后选取IXIO5细胞,加入多种荧光标记抗体,有CD45-FITC、CD29-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD44-FITC(均来源于晶美生物公司,)和相应的同型对照抗体,混合均勻后避光室温静置20分钟。随后加入2mlPBS,离心5分钟,移去上清,加入300μ1PBS,再次离心,上机检测