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酵母蔗糖酶的分离提取
姓名:xxx 学号:xxxx 指导老师:xx
xx大学 xx学院 10级1班邮编:xx
摘要:采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶,通过乙醇的分级与透析,得到较高纯度的酵母蔗糖酶。并对每次所提取的蛋白质浓度、酶活性、纯化倍数及产量做了相应的计算。,%。
关键词: 酵母蔗糖酶酶活力自溶法产量
前言:生物体内所发生的一切化学反应,几乎都是在专一性酶的催化下进行的,因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展,不论对酶分子本身作用机制的研究以及其他研究,越来越需要纯度高的酶制剂。蔗糖酶又称转化酶,可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。可用于转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖。蔗糖酶在畜牧方面,可防治禽兽的疾病,促进幼龄禽兽的发育,节约饲料和提高肉产量等;在农业方面可防治植物病害、刺激植物生长、提高作物产量;在工业上可用作鱼、肉、蔬菜和水果等食品的保鲜剂。


酵母粉(实验室提供), 醋酸钠(), 乙酸乙酯(8ml),10%醋酸,无水乙醇,1mol/LNaOH,蒸馏水,PH=,DNS试剂,%NaCl,考马斯亮蓝G-250,系列标准蛋白液,150mol/L 磷酸等。

离心机,722分光光度计,水浴锅,量筒25ml,烧杯100ml,大小试管若干,各种专用移液管,吸耳球,玻离棒,胶头滴管,PH试纸等。


(1)自溶法将5g酵母粉倒入500mL烧杯中、少量多次的加入15mL蒸馏水搅拌均匀,、8mL乙酸乙酯,搅匀,盖好,于35℃恒温水浴中搅拌30min。(注:整个实验应避免高温,以防止酶失活)
(2)抽提补加蒸馏水10mL,搅匀,盖好,于35℃恒温过夜,4000r/min 离心10min弃沉淀,得E1;量体积V1=,取出2mL置于4℃冰箱保存,待测酶活力及蛋白质浓度(留样1)。
(3)乙醇分级和透析
测E1 PH:用10%(注意少量、慢加、搅匀,防止调过), 10%HAC。
①第一次乙醇分级(30%乙醇饱和度)
计算出使E1得乙醇浓度达30%,将E1和乙醇X1,放入冰浴中预冷,在不断搅拌下缓慢滴加乙醇,4000r/min离心10min,弃沉淀,留上清,得E2;得到上清液为V2=(留样2)。
②第二次乙醇分级(50%乙醇饱和度)
同上法加入X2(为达50%乙醇饱和度时需要补加的无水乙醇的体积),。4000r/min离心10min,弃上清,沉淀立即用10ml 150mol/,并装入透析袋,透析6小时, 4000r/min离心10min,得E3,量体积V3=(留样3)。
③测定各步的总蛋白、总活力、并据此计算比活、回收率和纯化倍数。
纯化倍数=每次比活力/第一次比活力产量(%)=每次总活力/第一次总活力
——考马斯亮蓝G250染