实验一：DNA提取.ppt

实验一环境样品总DNA的提取
上海交通大学微生物分子生态学
与生态基因组学实验室
2004 07
重要性:
高质量DNA的提取是进行后续实验的基础
高质量DNA的提取是保证所进行的研究能更全面真实反映所研究的环境的微生物区系组成结构的前提。
Isolation of chromosome DNA
Discard proteins, Lipids
and carbohydrates
DNA的提取是传统分子生物学的常规技术:
环境样品:
种类繁多、组成复杂、物理化学性质多变
纯培养的细胞(inoculated bacteria)通常比环境中的原有的细胞(autochthonous bacteria)更容易裂解(Tsai and Olson 1991a; Tsai, Marie J. Park et al. 1991b; Jacobsen 1995)
没有一种方法能适用于所有的环境样品,每一种样品根据其特有的理化和生物学特性,都需要优化出一种特有的提取DNA的方法(Zhou, Bruns et al. 1996)。
本实验室已经建立的方法:
Wei, G. F., L. Pan, H. M. Du, J. Y. Chen, and L. P. Zhao. 2004. ERIC-PCR fingerprinting-munity DNA hybridization to pinpoint genome-specific fragments as molecular markers to identify and track mon to healthy human guts. J. Microbiological Methods. (in press)
Gao, P., and L. Zhao. 2002. DNA Extraction from Actived Sludge for munity Analysis. ACTA ECOLOGICA SINICA 22:2015-2019.
Yong, Z., Z. Zhihua, L. Wu, P. Yingjie, and Z. Liping. Simultaneous Recovery of Bacterial and munity Total DNA from Agricultural Soils. (preparing)
DNA提取效率的鉴定:
DNA的提取效率,也就是环境样品中有多大比例的微生物的总DNA被提取出来,是提取环境样品DNA的一个重要指标。
显微镜观察计数DNA提取前后的细菌细胞数在一些研究中被用来计算DNA回收效率。(Tsai and Olson 1991a) (Zhou, Bruns et al. 1996)
另一类计算DNA提取效率的方法是在提取DNA的时候加入外源的已知浓度的纯菌或DN***段。(Lee, Bollinger et al. 1996) (Mumy and Findlay 2004)
实验材料:
Activated sludge form A1-A2-O wastewater treatment system in Shanghai coking factory.
样品的保存:
采集的样品最好立即处理,如不能立即处理,可放在4℃冰箱中保存,为了尽量保证样品中微生物的原貌,保存时间不超过一天。
处理后的样品可以进行总DNA的提取,也可以添加20%的甘油(终浓度)保存于-70℃下。
样品前处理:
取大约30ml污水样品,4℃, 10000g,离心5min,收集沉淀。
加5倍体积的TENP buffer加玻璃珠充分旋涡(5min) 。
10000g,5min,4℃离心,收集沉淀(重复二次,如果离心后的上
清夜颜色较深,则重复这两步,直到上清夜较为澄清)。
加5倍体积的PBS buffer,旋涡,收集沉淀(重复二次)。
加PBS悬浮,分装到
离心管旋涡均匀。
DNA提取
加入20%甘油,
-70℃保存
TENP and PBS
TENP buffer:
50mM Tris,20mM EDTA,100mM NaCl, PVP,pH10
PBS buffer:
8g NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4,溶于1L水,