实验一 DNA提取.doc

实验一 DNA提取
实验一 DNA提取
实验一 DNA提取
实验一 DNA的小量制备
小量法提取植物基因组DNA(CTAB法)
1 实验目的:
随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用,人们经常需要提取高分子量的植物D叶片,放入1、5ml的EP管中, 加入液氮,用钢珠研磨成粉末状,再加入600μL的 CTAB提取缓冲液,;
5、3 65℃水浴锅中水浴40min,加入等体积的***仿:异戊醇(24:1),轻轻混匀,颠倒几次,乳化1min。4℃,11,000rpm离心10min;
5、4 吸上清到新离心管中(约400μl),加入等体积预冷异丙醇,混匀,-20℃放置20min沉淀DNA;
5、5 5000 rpm常温离心15min,倒掉上清液;
5、6 用75%乙醇(900μl)洗沉淀,11,000rpm离心2min,倒掉乙醇,再用乙醇同样处理一次;
5、7 置于干燥仪干燥10min,将水分蒸干;
5、8 加入50μL去离子水,融解 DNA,同时加入RNA酶(按每50μL DNA加入1μL RNase),37℃30min;
5、9 利用分光光度计检测OD260,同时进行1％凝胶电泳检测;
实验一 DNA提取
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实验一 DNA提取
5、10 琼脂糖电泳检测DNA:制作1%的琼脂糖凝胶,吸取提取的DNA溶液5μL电泳检测;
5、11 -20℃保存DNA备用;
5、12 提取的DNA的浓度检测:取少量待测DNA样品,用蒸馏水稀释1,000倍;用蒸馏水做空白,分别在260nm、280nm测DNA样品的吸光值。
【注意事项】
1、 叶片磨得越细越好。
2、 注意移液器的正确使用。
3、 由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。
6、 思考题
在什么溶液中较稳定?
的完整性,在吸取样品、抽提过程中应注意什么？
7 实验结果:
结果计算
式中OD260nm 为260nm 处的光密度;L 为比色杯光径(cm);0、020 为1μg/mL DNA 钠盐的光密度。
DNA 的紫外吸收高峰为260nm,吸收低峰为230nm,而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。上述DNA 溶液适当稀释后,在751 分光光度计上测定其OD260nm、OD230nm 与OD280nm。如OD260nm/ OD230nm≥2OD260nm/ OD280nm≥1、8,表示RNA 已经除净,蛋白含量不超过0、3％。
8 实验分析:
传统DNA提取方法
 CTAB 法、SDS 法就是在裂解细胞的基础上,多次苯酚***仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的;加入RNA 酶除去核酸中的RNA; 然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀,除去分离过程中残留的有机溶剂与盐离子,以免影响核酸溶解与抑制后续步骤的酶促反应,最后用TE 溶解DNA 备用。 
CTAB 就是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐( > 0、 7 mol/ L) 浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0、 1