实验一-DNA提取.doc

---------------------------------作者:_____________-----------------------------日期::_____________实验一-DNA提取实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA(CTAB法)1实验目的:随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用,人们经常需要提取高分子量的植物DNA,用于构建基因文库、基因组southern分析、酶切及克隆等,这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学****从植物材料中提取和测定DNA的原理并掌握CTAB提取DNA的方法,进一步了解DNA的性质。2实验原理细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物(DNP)的形式存在于细胞核内。提取DNA时,一般先破碎细胞释放出DNP,再用含少量异戊醇的***仿除去蛋白质,最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白(RNP)在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大,利用这一特性可将二者分离。以NaCl溶液为例:,而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1%。当NaCl浓度逐渐增大时,RNP的溶解度变化不大,而DNP的溶解则随之不断增加。当NaCl浓度大于1mol/L时,DNP的溶解度最大,为纯水中溶解度的2倍,。为了得到纯的DNA制品,可用适量的RNase处理提取液,以降解DNA中搀杂的RNA。关于植物总DNA的提取主要有两种方法::CTAB(十六烷基三***溴化铵,hexadecyltrimethylammoniumbromide,简称CTAB):是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中()是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度()时从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇中。:利用高浓度的阴离子去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠,Sodiumdodecylsulfate,简称SDS)使DNA与蛋白质分离,在高温(55~65℃)条件下裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸,然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/***仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA为107~109bp,在基因克隆工作中,通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上,否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端,导致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比例太低,严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两个原则:(1)尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质(如多酚、类黄***等)、多糖等杂质,并防止和抑制内源DNase对DNA的降解。(2)尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。几乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅因子,故实现(1)尽量去除蛋白质的要求,需加入一定浓度的螯合剂,如EDTA、柠檬酸,而且整个提取过程应在较低温度下进行(一般利用液氮或冰浴)。为实现(2)需要在DNA处于溶解状态时,尽量减弱溶