PCR技术及其应用PPT课件.ppt

PCR技术及其应用
§1 PCR技术原理
§2 PCR技术应用
PCR技术简史
DNA的复制
聚合酶链反应的发明
1971年,1971年,美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出:经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。
但由于测序和引物合成的困难,以及且当时(1970年)Smith等发现了DNA限制性内切酶,使体外克隆基因成为可能,所以,使Khorana等的早期设想被人们遗忘……
PCR技术简史
DNA的复制
聚合酶链反应的发明
1985年,美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(PCR);
基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制;
最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR,由于该酶不耐热,使这一过程耗时,费力,且易出错;
耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行,随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪;
1993年,Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖。
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>> ,1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
引物
引物
Mullis的构思
DNA聚合酶
DNA聚合酶
特定DN***段
Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)
酶活性(%)
温度(℃)
40 50 60 70 80 90 100
100
80
60
40
20
二、PCR的基本原理
PCR基本原理类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
PCR的基本步聚
1、变性(Denaturation) :通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离形成单链DNA 。
2、退火(Annealing) :当温度突然降低时,反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。
3、延伸(Extension ):在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在条件下,5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。
这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环,PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95℃)
Target Sequence
Target Sequence
PCR原理示意图
①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
5’
3’
3’
5’
TAGC
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
5’
3’
3’
5’
TAGC
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
加热94℃