总氮量的测定凯氏(microkjeldahl)定氮法.doc

一、目的
学****凯氏定氮法的原理和操作技术。
二、原理
常用凯氏定氮法测定天然有机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮量。
含氮的有机物与浓硫酸共热时,其中的碳、氢2元素被氧化成二氧化碳和水,而氮则转变成氨,并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是,这个反应进行得比较缓慢,通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点,并加入硫酸铜作为催化剂,以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下:
CH2NH2COOH+3H2SO4,一2CO2+3SO2十4H2O十NH3
2NH3+H2SO4一(NH4)2SO4
浓碱可使消化液中的硫酸铵分解,游离出氨,借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中,硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低,然后用标准无机酸滴定,直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止,最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。
三、试剂
1、消化液(过氧化氢:浓硫酸:= 3:2:1) 200mL
2、粉末硫酸钾—硫酸铜混合物 16g
K2S04与CuS04·5H201~2 3:1配比研磨混合
3、30%氢氧化钠溶液 1 000 mL
4、2%硼酸溶液
5、标准盐酸溶液( mol/L)
6、混合指示剂(田氏指示剂)
%%***红l醇溶液混合配成,贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色,碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。
7、市售标准面粉和富强粉①各2g
四、操作方法
1、凯氏定氮仪的构造和安装凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应管及冷凝器3部分组成。
蒸汽发生器包括电炉及一个1-2L(升)容积的烧瓶。蒸汽发生器借橡皮管与反应管相连,反应管上端有一个玻璃杯,其上端通过反应室外层与蒸汽发生器相连,下端靠近反应室的底部。反应室外层下端有一开口,上有一皮管夹,由此可放出冷凝水及反应废液。反应产生的氨可通过反应室上端细管及冷凝器通到吸收瓶中,反应管及冷凝器之间借磨口连接起来,防止漏气。安装仪器时,先将冷凝器垂直地固定在铁支台上,冷凝器下端不要距离实验台太近,以免放不下吸收瓶。然后将反应管通过磨口连接与冷凝器相连,根据仪器本身的角度将反应管固定在另一铁支台上。这一点务须注意,否则容易引起氨的散失及反应室上端弯管折断。然后将蒸汽发生器放在电炉上,并用橡皮管把蒸汽发生器与反应管连接起来。安装完毕后,不得轻易移动,以免仪器损坏。
2、样品处理某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(%)。因此在定氮前,应先将固体样品中的水分除掉。一般样品烘干的温度都采用105℃,因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。
在称量瓶中称人一定量磨细的样品,然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内,待降至室温后称重,按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后,称重一次,直到两次称量数值不变,即达恒重。
若样品为液体(如血清等),可取一定体积样品直接消化测定。
g左右的干燥面粉作为本实验的样品。
3、消化取4个100mL凯氏烧瓶或50mL消化管并标号。各加l颗玻璃珠,,催化剂(K2S04—CuS04·5H2O)200 mg,消化液5 mL。注意加样品时应直接送人瓶底,而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0,1 mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸,作为对照,用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放—漏斗,在通风橱内的电炉上消化。
当消化开始时应控制火力,不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完,硫酸开始分解并放出SO2白烟后,适当加强火力,继续消化,直至消化液呈透明淡绿色为止。消化完毕,等烧瓶中溶物冷却后,加蒸馏水10 mL。(注意慢加,随加随摇)。冷却后将瓶中溶物倾人50 mL的容量瓶中,并以蒸馏水洗烧瓶数次,将洗液并人量瓶。用水稀释到刻度,混匀备用。
(1)蒸馏器的洗涤蒸汽发生器中盛有用几滴硫酸酸化的蒸馏水。关闭皮管夹,将蒸汽发生器中的水烧开,让蒸汽通过整个仪器。约15分钟后,在冷凝器下端放一个盛有5 mL2%硼酸溶液和1
—2滴指示剂混合液的锥形瓶。位置倾斜,冷凝器下端应完全浸没在液体中,继续蒸汽洗涤1—2分钟,观察锥形瓶内的溶液是否变色,如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。向下移动锥形瓶,使硼酸液面离开冷凝管口约1 cm,继续通蒸汽1分钟。用水冲洗冷凝管口后用手捏紧橡皮管。此时由于反应室外层蒸汽冷缩,压力减低,反应室内凝结的水可自动吸出进入反应室外层。最后打开皮管夹,将废水排出。
(2)蒸馏取50 mL锥形瓶数个,各加5 mL硼酸和1~2滴指示剂,溶液呈紫