奶牛β-1,4-半乳糖基转移酶基因在毕赤酵母gs115中的转化表达及发酵优化.doc

奶牛β-1,4-半乳糖基转移酶基因在毕赤酵母GS115中的转化表达及发酵优化奶牛β-1,4-半乳糖基转移酶基因在毕赤酵母GS115中的转化表达及发酵优化江苏农业学报...,,:~://..姚晶,吴正钧,,,:?.奶牛,一半乳糖基转移酶基因在毕赤酵母中的转化表达及发酵优化姚晶,吴正钧,,光明乳业股份有限公司技术中心,上海;.上海海洋大学食品学院,上海摘要:采用电转化法将已构建好的表达载体?转化到毕赤酵母中。通过对电转化条件进行优化,达到了理想的转化效率,得到了大量转化子,并通过表型筛选及鉴定,筛选到阳性转化子。对重组的一进行了诱导表达,用?法检测到目的蛋白质条带,证明一,半乳糖基转移酶基因在中能够表达;用苯酚红法测定了粗酶液的活性,其比酶活为./。对工程菌的发酵条件进行了初步优化,在最佳工艺下的比酶活达到./,比优化前提高了.%。关键词:一,半乳糖基转移酶;电转化;诱导表达;发酵条件;优化中图分类号:.文献标识码:文章编号:?,,.,./.,.,,;.&,,,:?.,.?..一.?..一,?./.%../.:,;;;?;,一半乳糖基转移酶是催化半乳糖从要生物活性分子都含有的核心结构,例如,?。与炎症反应有关的唾液酸化路易斯,这个反应所生成的双糖?.乙酰乳糖***,是大多数重,与器官移植排斥反应有关的寡糖,,的合成反应。收稿日期:兴起于世纪年代的新兴表达系统毕赤酵基金项目:国家科技部计划;,由于其具有低成本、高表作者简介:姚晶一,男,江苏宜兴人,硕士研究生,研究方向:达量、高稳定性、修饰加工等优势,和大肠杆菌食品生物技术,..、,被广泛应用于外源基因,尤其是真核细胞功基,平板上进行甲醇快速利能基因的表达。电转化法由于其操作简单、快捷,已用型表型的筛选。挑取长得较快的转化子一一经成为将外源基因导人细胞中的首选方法。本对应地点在、平板相同位置上,,,并对电转化条培养基每天挥发的甲醇,?培养~,筛选在件及发酵条件进行优化,以期为相关活性物质的深、平板上都正常生长、且生长较快的菌落。入研究、体外合成及应用打下基础。随机挑选个阳性转化子,用微生物直接裂解缓冲液进行菌落,具体操作及体系参照试材料与方法剂使用说明书。引物为仅.:.一;:.菌株表达菌株为,复旦大学生命.。.%琼脂糖凝胶检测结科学学院惠赠;。有限公司乳业生物技术国家重点实验室构建保藏。.,购自公司;养基,培养聚合酶,,微生物直接裂解缓冲液基中,?/,培养至.~.。离心收集菌体,用诱导表达培养基为公司产品;细菌质粒小提试剂盒、普通纯化试.,重悬并剂盒、×蛋白质上样缓冲液稀释至鲫.,进行诱导培养。每隔加入甲醇至终浓度.%,并采样,取样时间点为、、蛋白质购自公司;.试剂盒购自迪申生物公司;其他试剂均为分析纯。、。样品/离心收集上清,.主要仪器液氮速冻并存于一?。在上清中添加等体积甲醇,电转化仪和分光光度计均为