BiaCore动力学亲和力及分析.pdf

动力学/ 亲和力分析基础知识介绍 Biacore Training 2 什么是动力学和亲和力? ? 动力学? 反应发生的速度? – 与时间相关? 结合– 分子间结合的速度? 解离– 分子复合物解离的速度? 动力学分析能够确定在一个给定的时间跨度内,分子复合物是否能够结合还是完全解离? 亲和力? 分子间结合的强度? – 与时间无关? 亲和力分析能够确定反应处于平衡状态(结合与解离形成动态平衡)时,复合物的浓度 Biacore Training 3 动力学分析和亲和力分析的相关性? ? 细胞本身就是一个动态系统– 极少处在平衡状态? 同样的亲和力,不同的反应,动力学数据一般并不相同? 动力学数据提供了更多的信息 Biacore Training 4 同样的亲和力,不同的动力学? 所有 4 个化合物的亲和力数据相同 K D = 10 nM = 10 -8 M ? 结合动力学常数可有不同数量级范围内的改变,本例中为 4 个数量级 k on k off (M -1 s -1 )( s -1 ) 10 6 10 -2 10 5 10 -3 10 4 10 -4 10 3 10 -5 时间浓度= 1000 nM 30 min 60 min 所有靶位点被占据 Response 时间 30 min 60 min 浓度= 100 nM Biacore Training 5 用 Biacore 获得动力学和亲和力数据的 3 种方式? 监测结合和解离速率? 亲和力动力学? 监测稳态水平? 亲和力动力学? 监测溶液中游离的分析物分子? 亲和力动力学 Biacore Training 7 平衡常数(Equilibrium constants) The equilibrium constants: -1 [M ] the constant equilibrium association the dissociation constant equilibrium k a k d k d k a [AB] [A] [B] [M] [AB] [A] [B] A t equ ilib r i um: Association Dissociation k d [AB] [A] [B] k a s -1 M s-1-1 MM M K A K D Biacore Training 8 Biacore 中的平衡和动力学? A 是溶液中的待分析物(analyte) ? A 的游离浓度由流动系统控制,在检测中保持恒定? AB 是结合复合物? AB 的浓度可通过直接检测 RU 得到,表示为 R ? B 是偶联在传感芯片上的分子? 总浓度能用 RU 表示, 相当于最大结合反应理论值 Rmax ? B 的游离浓度即 Rmax-R A + B ? AB k a k d 我们无需知道复合物和配体的实际浓度! Biacore Training 9 Biacore 中的速率和亲和力 A B k a k d AB k a k d [AB] [AB] d dt [A] [B] RU/s MRU RU dR dt k a k d max R] [R R C A B has one binding site and reacts with immobilized ligandhas n identical and independent binding sites s -1 M s-1-1 Biacore Training 10 传感图中的变量和表示方式