具体的操作步骤是,RNA提取,随机引物反转录,反转录产物10倍稀释,real-time 。一步法是把反转录和扩增联合起来做,不推荐使用。
具体的考前须知有
1:高质量的RNA获取,这里的高质量不是强调RNA沉淀,去上清;
5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min),超净台风干;
6)参加适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。
四、总RNA纯度和完整性检测
1)纯度检测:取1μl RNA样品50倍稀释,在核酸蛋白检测仪上测定OD值,OD260/,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染。
2)总RNA完整性检测:取RNA样品1μl,1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min,EB染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照,总RNA的5s rRNA, 18s rRNA和28s rRNA条带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比拟完整。
五、逆转录
1. mRNA:
1) 在RNase free的PCR管中配置以下溶液.
Total RNA
H2O
µg
µl
总体积
12
µl
2) 将上述溶液吹打均匀,置85℃保温5min,使RNA变性。随后立即冰上致冷, 以防止RNA复性;
3) 在该PCR管中参加以下试剂(Promega)
oligo〔dT〕
Random primer
10mM dNTP
RNase inhibitor
5 x buffer
M-MLV
µl
µl
µl
µl
µl
µl
总体积
µl
4) 将上述20μl反响溶液30℃保温10min;
5) 42℃保温50min;
6) 85℃保温10min;
7) -20℃保存。
2. microRNA:
使用茎环逆转录法,原理如以下列图:
1) 在去RNase的PCR管中配置以下溶液.
total RNA
X个miR逆转录引物
H2O
*X
µg
µl
总体积
µl
2)将上述溶液混匀,85℃孵育5min,以翻开RNA二级结构。随后立即置于冰上,以防止RNA复性再次恢复二级结构;
3) 在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液:
10mM dNTP (promega)
RNase inhibitor (promega)
U6逆转录引物
5x buffer
M-MLV (promega)
µl
µl
µl
µl
µl
总体积
µl
4) 将3)溶液参加到1)溶液中,混匀后30℃保温10min;
5) 42℃孵育50min;
6) 85℃孵育10min灭活逆转录酶。
四、定量PCR检测
:
根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率,具体反响体系和反响条件如正式实验,每对引物需做模板水对照。
得到结果后,首先根据熔解曲线判断引物特异性,选择标准为:单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。假设设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好,那么应比照各引物的扩增曲线,优先选择C
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