qPCR操作步骤.docx

qPCR操作步骤
qPCR操作步骤
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详细的操作步骤是， RNA 提取，随机引物反转录，反转录产物 10 倍稀释， real-time PCR. 这个是标准的两步法。一步
法 是器
混匀 )，室温静置 10min;
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5)4 ℃下，

14,000g

离心

10min

，采集

RNA

积淀 (如离心后仍不见

EP

管底部有
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积淀，应将

EP

管搁置在

-80

度冰箱留宿，持续在

4℃下， 14,000g

离心

10min

，收
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集

积淀 )，去上清
qPCR操作步骤
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6) 用 75% 乙醇清洗两次 (12,000g 离心 5min)( 加入乙醇后只要轻轻颠倒 EP 管即
可，不用振荡器震荡或枪头吸打积淀 )，超净台风干 ;积淀不可以过干或过湿，过干则
不易溶解，过湿则乙醇残留。
视积淀量加入适当 DEPC 水 (起码 15ul) 溶解积淀。三、去 基因组
使用 RNase-free
的 DNase ?(Promega)
，按以下系统配置反响液， 37 ℃消化
30min ， 65℃灭活 10min 。
RNA?
30
μl
DNase ?
20
μl
10 x buffer
10
μl
H2O(RNase free)

μl
RNasin

μl
整体积
100
μl
而后按以下步骤操作：
1) 加入等体积的苯酚 /***仿，上下颠倒混匀，室温搁置 5min ，后 14,000rpm ，
离心 15min ，取上清。
2) 加入等体积的***仿，上下颠倒混匀，静置分层后 14,000rpm ，离心 15min ，
取上清。
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3) 加入等体积异丙醇，柔和地充足混匀 (颠倒 6-8 次 )， -20 ℃静置 15min;
4)4 ℃下， 14,000g 离心 15min ，采集 RNA 积淀，去上清 ;
5)
用 75% 乙醇清洗两次 (12,000g 离心 5min) ，超净台风干 ;
6)
加入适当 DEPC 水 (起码 15ul) 溶解积淀。
四、总 RNA 纯度和完好性检测
1)
纯度检测：取 1μ l RNA 样品 50 倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定
OD 值，
OD260/OD