鸡胚成纤维细胞的培养2008.ppt

鸡胚成纤维细胞的培养
切取意欲培养的动物器官或组织
剔除多余成分
洗去血污
将所取组织剪碎
胰酶消化
机械方法吹打组织块
反复冲洗除去胰酶
静置
加入培养液重悬成细胞悬液
计数
细胞培养
原代培养的基本实验流程:
[目的要求]
掌握鸡胚原代细胞培养操作的基本程序,观察单层细胞生长情况。
[实验材料]
9~10日龄鸡胚,PBS液50mL, %胰蛋白酶5mL、 DMEM培养液20mL(内含犊牛血清1mL,,),手术剪,镊子,灭菌的培养皿,滴管若干,细胞瓶,蛋座,75%酒精,水浴锅。
[实验内容及操作程序]
1. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上,用碘酊消毒气室,以镊子击破卵壳并弃之,撕破卵膜,继撕破绒尿膜、羊膜,取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏,用PBS液(简称P液)洗去体表血液,移入另一灭菌平皿中,用灭菌剪刀剪碎鸡胚,使成为约1mm3大小的碎块,加3mL P液轻摇,后将P液与组织碎块一起用滴管移入细胞瓶中。
,按组织块量约3~5倍加入细胞瓶中,1个鸡胚约需5mL胰酶,细胞瓶上加塞,以免污染。37℃水浴约20min左右,每隔5min轻轻摇动1次,由于胰酶作用,使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离,待液体变混而稍稠,轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时,则需中止消化,如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长,如果消化不够,则细胞不易分散。
PBS(目的是稀释胰酶浓度终止胰酶的消化),充分混匀后静置1min, 让组织块下沉后,吸去上层胰酶液(千万小心不要吸掉下层组织块)------就是放多少胰酶液就吸多少出来,用PBS液共反复洗3次,以洗去胰酶。
,加2mL含5%小牛血清DMEM培养液于细胞瓶中,以***吸管反复吹吸数次,使细胞分散,此时可见营养液混浊即为细胞悬液。将细胞悬液静置一分钟,以使未冲散的细胞块下沉,-,细胞瓶内吸入4mL的5%小牛血清DMEM,计数。
注:本实验过程中,在前一步吸取DMEM时,宜同时将4mL培养液分装到细胞瓶。
%结晶紫一柠檬酸()溶液2mL,置室温或37℃温箱中5~10min,充分振动混合后,用毛细管吸取滴人血细胞计数板内,在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法,计算四角大格内完整细胞的总数。如3~5个聚集在一起,则按1个计算,然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。
细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数
注意事项 1、 务必使细胞分散成单个细胞,取样计数前,应充分混匀细胞悬液。 2、 对于分布在刻线上的细胞,依照“数上不数下,数左不数右“的原则进行计数。计数时,如发现各中方格的细胞数目相差20个以上,表示细胞分布不均匀,必须重新计数
℃中进行培养.