鸡胚成纤维细胞原代培养实验.docx

鸡胚成纤维细胞原代培养
实验材料、用品
鸡胚： 9-11 日龄
器材：平皿、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、离心机、天平、
离心管、 100 目不锈钢网、镊子、眼科小剪、细胞计数器、枪头、
移液器等。
试剂：Hanks液、完全培养液、血清、碘酒、酒精
方法
1．取胚：取 9-11 日龄鸡胚，碘酒、酒精消毒气室部，去除
气室部蛋壳，用无菌小镊取出鸡胚于无菌平皿中。
.去头、爪、内脏，鸡胚组织Hanks液洗2次，除去红细胞， 剪成1mm3组织块，用Hanks液洗2次,800rpm3min,去上清。
． 加 2 倍体积胰酶搅拌消化 15-30min ， 分散好的细胞悬液加
完全培养基，通过不锈钢筛网，滤液离心，沉淀加完全培养液 ,分
散。
4．细胞计数，接种培养与分装：取单细胞悬液少量， 进行 1：
5 或 1： 10 稀释后计数，然后调至细胞浓度为 1x106／ ml 。
细胞计数方法：取细胞悬液，计数 4 角 4 个大方格细胞总数，
用下式计数：
培养细胞的活性检查
材料
．细胞
． % w/v trypan blue 、 75%乙醇。
.培养瓶，无菌吸液管（5ml及1m1）、废液瓶、盖玻片。
. 倒置显微镜、计数器、血球计数板、离心机、 C02 培养箱、
超净台、枪头、移液器。
方法
细胞悬液制备
选生长良好的细胞一瓶，轻轻摇动培养瓶，悬浮细胞碎片，
吸出生长液，用 Hanks 液洗一次；
加入适量 ％胰蛋白酶液， 使消化液浸没细胞， 置 37℃
培养箱， 1min 左右，镜检。
待细胞圆缩后，吸出消化液。
置 37℃培养箱，随时镜检，。
待细胞变圆，加入完全培养基，洗下细胞，吹打混匀。
取细胞悬浮液 50ul 与等体积 trypan blue 混匀。
取 10ul 混合液滴入血球计数板，于 100 倍倒置显微镜下观
察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色。
计数：
培养细胞传代
材料
1 ．细胞培养物
2 . Hanks液， %胰酶，培养基
3 ．培养瓶、废液瓶、倒置显微镜、计数器、血球计数板、离
心机、 C02 培养箱、超净台、离心管、枪头、移液器。
操作方法
选生长良好的细胞一瓶，轻轻摇动培养瓶，悬浮细胞碎片，
吸出生长液，用 Hanks 液洗一次；
加入适量 ％胰蛋白酶液，使消化液浸没细胞，置 37℃
培养箱， 1min 左右，镜检。
待细胞圆缩后，吸出消化液。
置 37℃培养箱，随时镜检，。
待细胞变圆， 加入完全培养基， 洗下细胞， 吹打混匀。 按 1：
2 或 1： 3 分配到培养皿中，补足培养液进行传代培养。
细胞冻存
材料
1 ．细胞培养物
培养液、 %胰酶、 冻存液、 枪头、 移液器、 冻存管、 记号笔、
线绳、酒精灯、酒精棉球、液氮罐、冰箱、离心机、超净台
操作方法
选生长良好的细胞一瓶， 轻轻摇