鸡胚成纤维细胞原代培养实验.docx


文档分类:医学/心理学
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鸡胚成纤维细胞原代培养实验.docx
文档介绍
鸡胚成纤维细胞原代培养
实验材料、用品
鸡胚: 9-11 日龄
器材:平皿、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、离心机、天平、
离心管、 100 目不锈钢网、镊子、眼科小剪、细胞计数器、枪头、
移液器等。
试剂:Hanks液、完全培养液、血清、碘酒、酒精
方法
1.取胚:取 9-11 日龄鸡胚,碘酒、酒精消毒气室部,去除
气室部蛋壳,用无菌小镊取出鸡胚于无菌平皿中。
.去头、爪、内脏,鸡胚组织Hanks液洗2次,除去红细胞, 剪成1mm3组织块,用Hanks液洗2次,800rpm3min,去上清。
. 加 2 倍体积胰酶搅拌消化 15-30min , 分散好的细胞悬液加
完全培养基,通过不锈钢筛网,滤液离心,沉淀加完全培养液 ,分
散。
4.细胞计数,接种培养与分装:取单细胞悬液少量, 进行 1:
5 或 1: 10 稀释后计数,然后调至细胞浓度为 1x106/ ml 。
细胞计数方法:取细胞悬液,计数 4 角 4 个大方格细胞总数,
用下式计数:
培养细胞的活性检查
材料
.细胞
. 0.4 % w/v trypan blue 、 75%乙醇。
.培养瓶,无菌吸液管(5ml及1m1)、废液瓶、盖玻片。
. 倒置显微镜、计数器、血球计数板、离心机、 C02 培养箱、
超净台、枪头、移液器。
方法
细胞悬液制备
选生长良好的细胞一瓶,轻轻摇动培养瓶,悬浮细胞碎片,
吸出生长液,用 Hanks 液洗一次;
加入适量 0.25 %胰蛋白酶液, 使消化液浸没细胞, 置 37℃
培养箱, 1min 左右,镜检。
待细胞圆缩后,吸出消化液。
置 37℃培养箱,随时镜检,。
待细胞变圆,加入完全培养基,洗下细胞,吹打混匀。
取细胞悬浮液 50ul 与等体积 trypan blue 混匀。
取 10ul 混合液滴入血球计数板,于 100 倍倒置显微镜下观
察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色。
计数:
培养细胞传代
材料
1 .细胞培养物
2 . Hanks液,0.25 %胰酶,培养基
3 .培养瓶、废液瓶、倒置显微镜、计数器、血球计数板、离
心机、 C02 培养箱、超净台、离心管、枪头、移液器。
操作方法
选生长良好的细胞一瓶,轻轻摇动培养瓶,悬浮细胞碎片,
吸出生长液,用 Hanks 液洗一次;
加入适量 0.25 %胰蛋白酶液,使消化液浸没细胞,置 37℃
培养箱, 1min 左右,镜检。
待细胞圆缩后,吸出消化液。
置 37℃培养箱,随时镜检,。
待细胞变圆, 加入完全培养基, 洗下细胞, 吹打混匀。 按 1:
2 或 1: 3 分配到培养皿中,补足培养液进行传代培养。
细胞冻存
材料
1 .细胞培养物
培养液、 0.25%胰酶、 冻存液、 枪头、 移液器、 冻存管、 记号笔、
线绳、酒精灯、酒精棉球、液氮罐、冰箱、离心机、超净台
操作方法
选生长良好的细胞一瓶, 轻轻摇
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