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实验十二转氨作用
【实验目的】

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【实验原理】
转氨基作用是由转氨酶(氨基转移酶)催化的,在这个反应中,α-氨基酸的氨基与α-***酸的***基之间交换,α-氨基酸转变成相应的α-***酸,α-***酸变成新的一种α-氨基酸。转氨基作用是一种可逆反应。每个转氨基反应均由专一的转氨酶所催化,在不同的生物有机体中均有转氨酶分布。
本实验是将丙氨酸和α-***戊二酸与肝匀浆一起水浴反应,肝中的丙氨酸氨基转移酶(ALT,又称谷丙转氨酶GPT)含量丰富,该酶可将丙氨酸的氨基转移给α-***戊二酸,产生***酸和谷氨酸。利用圆盘纸层析鉴定谷氨酸的存在,并且验证组织中的转氨作用。在肝脏谷丙转氨酶(GPT)催化的转氨基作用,反应方程式如下:
【实验材料】
实验器材
培养皿;表面皿;滤纸;匀浆器;试管;试管架;恒温水浴锅;毛细管;移液管;喷雾器;剪刀;铅笔;格尺。
实验试剂
⑴ :, ,蒸馏水稀释20倍。
⑵ :,,用磷酸盐缓冲液加至100ml。
⑶ -***戊二酸溶液:称取a-*** ,用1M ,用磷酸盐缓冲液加至100ml。
⑷ : , ,用磷酸缓冲液加至100ml。
⑸ %茚三***溶液:称取茚三*** 95%乙醇中。
(6)层析溶剂:水饱和的苯酚。
【实验操作】
肝匀浆的制备:
取新鲜的猪肝5g, ,用捣碎机迅速成匀浆(1万转大约30秒)。两人一组进行如下的实验。
转氨反应:
取干燥大试管二支,分别标明测定管与对照管,按下表进行操作:
试剂(ml)
测定管
对照管
肝匀浆


放入沸水中煮5分钟,
冷却,摇匀
丙氨酸溶液


α-***戊二酸溶液


M 磷酸缓冲液


摇匀,放进37℃水浴保温50分钟
沸水浴中煮5分钟,终止反应,取出冷却后摇匀
取出冷却后,分别用滤纸过滤或2000rpm离心3~5分钟,滤液或上清液分别收集到新的干燥小试管中。
3. 纸层析:
⑴取直径12cm圆形滤纸一张,通过圆心作两条2cm相互垂直的线,两个线的末端作点样点,分别标定“测定”、“对照”、“谷氨酸”、“丙氨酸”。
⑵取4支毛细管,分别吸取测定管溶液、、对照管溶液、。在点样处点样,注意斑点不可太大,。而且每点一滴,吹干后方可再点第二滴,每个样品可点2~3次。
⑶在滤纸圆心处打一小孔(1mm直径),另取同类滤纸条(×),下一半剪成须状,卷成圆筒,如灯芯,从点样相反的一侧插入小孔。
⑷将层析溶剂(水饱和酚