DNA第一代,第二代,第三代测序介绍.docx

DNA第一代,第二代,第三代测序介绍.docx原理是:核酸模板在 DNA聚合酶、引物、 4 种单脱氧核苷三磷酸( d NTP,其中的一种用放射性 P32 标记) 存在条件下复制时,在四管反响系统中分别按比率引
入 4 种双脱氧核苷三磷酸( dd NTP ) ,由于双脱氧核苷没有 3’-O H,因此只要双脱氧核苷掺入链的尾端, 该链就停止延伸, 假设链端掺入单脱氧核苷, 链就可以连续延伸。这样每管反响系统中便合成以各自
的双脱氧碱基为 3’端的一系列长度不等的核酸片段。反响停止后,分 4 个泳道进行凝胶电泳, 分别长短不一的核酸片段, 长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,依照片段 3’端的双脱氧核苷,即可依次阅读合成片段的碱基排列序次。 Sanger 法因操作简略,获得广泛的应用。此后在此基础上睁开出多种 DNA 测序技术,其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术
荧光自动测序技术基于 Sanger
原理,用荧光标记代替同位素标
记,并用成像系统自动检测,从而大大提高了
D NA 测序的速度和正确性。
20 世纪 80 年代
初 Jorgenson
和 Lukacs
提出了毛细管电泳技术
( c a p il l ar y el
ect
r
ophor es i s ) 。
1992 年美国的 Mathies
实验室第一提出阵列毛细管电泳
(
c a p il
l ar
y ar
r a y el ectr
ophor es i s )新方法,并采用激光聚焦荧光扫描检测装置,
25 只毛细管并列电泳,每只
毛细管在内可读出 350 bp , DNA 序列, 解析效率可达 6 000 bp/h 。1995
年 Woolley 研究组
用该技术进行测序研究,使用四色荧光标记法,每个毛细管长,在
9min 内可读取 150 个碱
基,正确率约
97 % 。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司
(ABI)3730
系列自动测
序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的
D NA测序仪。如
ABI3730XL 测序仪拥有 96 道
毛细管,4
种双脱氧核苷酸的碱基分别用不相同的荧光标记
,
在经过毛细管时
不相同长度的
DNA 片段上的
4 种荧光基团被激光激发
, 发出不相同颜色的荧光
,
D 检测
系统鉴别,
并直接翻译成
DNA 序列。
杂交测序技术杂交法测序是 20
世纪 80
年代末出现的一种测序方法
,
该方法不相同于
化学降解法和
Sanger 法,
而是利用 DNA 杂交原理,
将一系列序列的单链寡核苷酸片
段固定在基片上
, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交
, 依照杂交情况排列出样品的
序列
序检测速度快, 采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的本钱,具
有局部第二代测序技术的特点。但 该方法误差较大 , 且不能够重复测定
焦磷酸测序(pyrosequencing) 技术是近来几年来睁开起来的一种新的 DNA序列分
析技术,它经过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸惹起酶级联反响, 促使荧光素发光并进行检测。既可进行 DNA序列解析,又可进行基于序列解析的单核苷酸多态性(SNP)检测及等位基因频率测定等。
焦磷酸测序技术的原理