植物细胞培养.ppt

植物细胞培养
2、由培养组织分离单细胞
茎段
步骤：
(1) 诱导产生愈伤组织；
(2) 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；
摇床用于振荡
继代
悬浮
(3)将愈伤组织在液体培养基中培
一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：
悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。
6、影响悬浮细胞生长的因素：
 起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。
 接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，～×105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。
 培养条件：方式、温度、继代周期
四、悬浮细胞的同步化
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态，工作中常用的处理方法：1、物理方法1）分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。
Fujimura分离胡萝卜悬浮液悬浮液 47μm膜过滤 滤液 31 μm膜过滤 收集加入到10%~18%的Ficoll 加入等体积的培养基 网上细胞180g离心5min 收集各细胞层的细胞 用培养基洗涤 分别接种
2）冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度。2、化学方法1）饥饿法 悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。
2）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。 常用的抑制剂有5-***脱氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羟基尿等。3）有丝分裂阻抑用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，%，处理时间以4-6小时为宜。
无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。用于处理 的细胞系最好处于对数生长期。
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一、植物单细胞培养的意义1、建立单细胞无性系 悬浮培养细胞间细胞间在遗传、生理和生化上存在差异，这些差异反映在它们的产量、品质、抗病虫性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、高品质的细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经济效益。2、排除体细胞的干扰3、利于对细胞活动跟踪观察
二、单细胞培养的方法
1、细胞平板培养概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养 主要技术要点： 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml
植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺在培养皿中，其厚度为1-2mm。 待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或parafilm封口膜将培养皿封严以防污染在25℃黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。
植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。  植板率(％)＝(形成的细胞团数/接种的细胞数)×100％计算式中每个平板新形成的细胞团数的计数方法有两种：一是直接计数法，注意计量时要掌握合适的时间，即细胞团肉眼已能分辨，但尚未长合到一起的时候。二是感光法，在暗室