氨基转移作用实验报告.doc

氨基转移作用实验报告肌肉组织的氨基转换作用实验报告浙大生化实验报告氨基转换反应实验报告课程名称:生化实验甲指导老师:成绩:__________________实验名称:氨基移换反应及其产物的鉴定实验类型:同组学生姓名:一、实验目的和要求(必填)二、实验内容和原理(必填)三、实验材料与试剂(必填)四、实验器材与仪器(必填)五、操作方法和实验步骤(必填)六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析(必填)八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学****鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理;2、学****纸层析的原理和操作技术。二、:在氨基移换酶(转氨酶)的催化下,氨基酸的α-氨基和α-***酸的α-***基之间发生的互换反应。转氨酶的种类很多,任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。,在各种转氨酶中,谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的活性最强。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶(glutamicpyruvictransaminase,GPT)、谷草转氨酶(glutamicoxalacetictransaminase,GOT)活性较高。GPT催化下的转氨基反应为:L,谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富,活性高,催化L,谷氨酸氧化脱,NH2,加碘乙酸能抑制其活性,从而可以保护氨基移换反应的产物L,谷氨酸。本实验用纸层析法,检查由丙氨酸和α—***戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶(GPT)的作用下所生成的谷氨酸,证明组织内的氨基移换作用。:滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况(溶解度)的不同来分离混合物的一种技术。层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性,因此吸附一层水作为固定相,而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时,由于被分离物质的组分在两相中的分布不同,随着流动相的移动,物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配,从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快,在固定相中溶解度大的组分移动慢,于是得到分离。用滤纸层析法分离氨基酸,是根据氨基酸样品的R基团的化学结构或极性大小的不同,将样品氨基酸溶解在适当的溶剂()中,点样在滤纸的一端,再选用适当的溶剂系统(酚溶液),通过毛细现象向另一端展层,展层完毕后,用茚三***作为显色剂,即可得到氨基酸样品的分离图谱。***的显色原理:氨基酸+茚三***类紫红色复合物三、实验材料与试剂1、实验材料动物肝脏(牛蛙肝或猪肝)2、实验试剂?()(转氨基反应所需缓冲溶液);?,丙氨酸()(转氨基反应的底物,纸层析的标准样品);?,***戊二酸()(转氨基反应的底物);?()(纸层析的标准样品);?展层溶剂,酚溶液:水饱和酚:冰乙酸(300:1)(纸层析用);?10,三***乙酸(终止酶促反应,使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀);?%碘乙酸(抑制L,谷氨酸脱氢酶活性);?显色剂(%茚三***-乙醇溶液)。四、实验器材与仪器?研钵;?试管及试管架;?恒温水浴箱(37?、100?);?铅笔、尺和圆规;?毛细管();?新华定性滤纸(直径11cm);?剪刀和镊子;?电吹风;?滴管;?康氏皿;?喷雾器;?烘箱(80?)。五、实验操作方法和步骤1、转氨酶液的制备取新鲜牛蛙肝或猪肝约3g,剪碎用研钵将肝脏碾碎,加3ml磷酸缓冲液迅速碾磨,加9ml磷酸缓冲液,用两层纱布过滤,收集浆液或滤液即得转氨酶提取液备用。2、氨基移换反应取4支洁净、干燥的试管,按下表操作3、层析?准备:?取新华定性滤纸(直径11cm)一张,找出圆心,用圆规画一直径2cm的细圆圈(保持干净),并按图1用铅笔作出点样位置。找出圆心,用铅笔尖在圆心处截一小孔()。?另取2cm×3cm滤纸,先将下端剪成须状,卷成“灯芯”,备用。?点样:用毛细管依次点标准α,丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)各点2次,其余1,4号管样液各点2,3次。点样时,要待前次点样干燥(可用电吹风吹干)后方可再次点样,。?展层、显色将下端剪成须状,卷成的“灯芯”,然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔中,平放在盛有展层溶剂的康氏皿中,使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中,再在滤纸上盖上另一康氏皿(图1)。展层剂沿灯心上升到滤纸,再向四周扩散,(约需半小时),取出滤纸,用镊子拔出灯心,滤纸用电吹风吹干,%茚三***,乙醇溶液,用电吹风热风吹干或放入烘箱(80?)