转氨基实验报告.doc

转氨基实验报告.doc转氨基实验报告
实验六纸层析法观察转氨基作用
【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用
09救援一班第三大组李岚宇XX222336
室温：28° 实验目的：
1、 学****氨基酸纸层析的基本原理。
2、 掌握氨基酸纸层析的操作原理。
实验原理：
转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在 转氨酶的催化下，氨基酸的a -***酸与a -***基的互换反应 称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器 官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由 专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的a —氨基转移到另 一a—***基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙 氨酸氨基转移酶催化如下反应： a —***戊二酸+丙氨酸谷氨酸+***酸
本实验以丙氨酸和a-***戊二酸为底物，加肝匀浆保温 后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。 纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲 合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。 有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使
流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动 进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异， 而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组 分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势 较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物 质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示：？???ALT
物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值R f 也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分 离的物质。
实验材料与仪器：
试剂：
1、/LpH磷酸盐缓冲液。
2、 /LNa2HP04 溶液 81ml 与/LNa H2P04 溶液 19m 1 混匀, 用蒸憎水稀释20倍。
3、 /L丙氨酸溶液称取丙氨酸克，先溶于少量/Lp H磷酸 盐缓冲液中，以NNaOH仔细调至后，加磷酸盐缓冲液至1 00ml。
4、 /La—***戊二酸称取a —***戊二酸克，先溶于少量 /LpH磷酸盐缓冲液中，以NNaOH仔细调至pH后，加磷酸盐 缓冲液至100m lo
5、 /L谷氨酸溶液称取谷氨酸克，先溶于少量/LpH磷酸 盐缓冲液中，以NN aOH仔细调至pH后，加磷酸盐缓冲液至 5 0ml o
6、 ％苗三***溶液称取苗三***克于100ml***中溶解。
7、 层析溶剂：将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合 后，放入分液漏斗中，震荡，静置24小时后分层，将下部 酚层转移到瓶中备用。
仪器：玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸 水浴锅、37°C恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、 分液漏斗。
实验步骤：
1、肝匀浆制备：取新鲜动物肝克,剪碎后放入匀浆器, 加入冷/LpH磷酸盐缓冲液m 1,迅速研成匀浆，用上述缓冲 液混匀备用。
2、 酶促反应过程
取离心管两支，编号：1、2,各加肝匀浆0 .5mlo把 对照管放沸水浴中加热10分钟，取出冷却。
各加/L丙氨酸ml, /L a -***戊二酸ml, /LpH磷酸盐缓冲 液
m 1,摇匀。
37°C保温，30分钟后取出，保温完毕。
把测定管放沸水浴中煮10分钟，取出后冷却，过滤。
3、 层析
取圆形滤纸一张放洁白纸上，以圆点为中心，约lcm 为半径，用铅笔划一圆线作为基线，在线上四等份处标清四
点编号作为点样原点。
点样：用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、 谷氨酸液分别点在原点2、4处。把测定液、对照液分别点 在原点1、3处。注意斑点不宜过大。在第一次点样点干后, 再在原处同样点第2次。
层析：先在滤纸圆心处打一小孔，再取滤纸一条卷成 捻如灯芯状，上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。
把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入层析液中, 盖上培养皿盖。可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向 四周扩散。当层析液前缘到离滤纸边缘约lcm时，约25分 钟，取出滤纸，用银子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。
显色：将上述滤纸平放在培养皿上，滴％苗三***的丙 ***溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫 色斑出现，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算Rf值，分 析是否发生了转氨基反应。
实验结果记录：
图
实验讨论：
1、从表格中可以看出，测定管上清液点样出现了两个 色斑，根据Rf值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生 了转氨基作用，生成的未知物质b为谷氨酸，则未知溶质a 为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应,
只有丙氨酸，所以色斑只有一个。
2、 层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸, 以免污染。
3、 层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅 到皮肤及眼睛。
4、点样点不宜过大，直径小于
XX年