转氨基实验报告.docx

转氨基实验报告.docx转氨基实验报告实验六纸层析法观察转氨基作用【实验名称】:纸层析法观察转氨基作用09救援一班第三大组李岚宇XX222336室温:28°实验目的:1、 学****氨基酸纸层析的基本原理。2、 掌握氨基酸纸层析的操作原理。实验原理:转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应,在转氨酶的催化下,氨基酸的***酸与a-***基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中,是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化,此酶催化氨基酸的a—氨基转移到另一a—***基酸上。各种转氨酶的活性不同,其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶催化如下反应:a—***戊二酸+丙氨酸谷氨酸+***酸本实验以丙氨酸和a-***戊二酸为底物,加肝匀浆保温后,用纸层析法检查谷氨酸的出现,以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物,滤纸纤维与水亲合力强,水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶,把预分离物质加到滤纸的一端,使流动溶剂经此向另一端移动,这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异,而使移动速度就不一样,在固定相中,分配趋势较大的组分,随流动相移动的速度就慢,反之,在流动相分配趋势较大的成分,移动速度快,最终不同的组分彼此分离,物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示:????ALT物质在一定的溶液中的分配系数是一定的,故比值Rf也相对稳定,因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。实验材料与仪器:试剂:1、/LpH磷酸盐缓冲液。2、 /LNa2HP04溶液81ml与/LNaH2P04溶液19m1混匀,用蒸馆水稀释20倍。3、 /L丙氨酸溶液称取丙氨酸克,先溶于少量/LpH磷酸盐缓冲液中,以NNaOH仔细调至后,加磷酸盐缓冲液至100ml。4、 /La-***戊二酸称取ct一***戊二酸克,先溶于少量/LpH磷酸盐缓冲液中,以NNaOH仔细调至pH后,加磷酸盐缓冲液至100mE5、 /L谷氨酸溶液称取谷氨酸克,先溶于少量/LpH磷酸盐缓冲液中,以NNaOH仔细调至pH后,加磷酸盐缓冲液至50mlo6、 %前三***溶液称取苗三***克于100ml***中溶解。7、 层析溶剂:将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后,放入分液漏斗中,震荡,静置24小时后分层,将下部酚层转移到瓶中备用。仪器:玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37°C恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。实验步骤:1、肝匀浆制备:取新鲜动物肝克,剪碎后放入匀浆器,加入冷/LpH磷酸盐缓冲液m1,迅速研成匀浆,用上述缓冲液混匀备用。2、 酶促反应过程取离心管两支,编号:1、2,,取出冷却。各加/L丙氨酸ml,/La-***戊二酸ml,/LpH磷酸盐缓冲液m1,摇匀。37°C保温,30分钟后取出,保温完毕。把测定管放沸水浴中煮10分钟,取出后冷却,过滤。3、 层析取圆形滤纸一张放洁白纸上,以圆点为中心,约lcm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。点样:用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4处。把测定液、对照液分别点在原点1、3处。注意斑点不宜过大。在第一次点样点干后,再在原处同样点第2次。层析:先在滤纸圆心处打一小孔,再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中,下端剪成须状。把滤纸平放在上述培养皿上,使纸芯下浸入层析液中,盖上培养皿盖。可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心,渐向四周扩散。当层析液前缘到离滤纸边缘约lcm时,约25分钟,取出滤纸,用银子小心取下纸芯,放入烘箱中烘干。显色:将上述滤纸平放在培养皿上,滴%苗三***的***溶液,使滤纸全部湿润,再放入烘箱干燥,此时可见紫色斑出现,比较色斑的位置,及色泽深浅,计算Rf值,分析是否发生了转氨基反应。实验结果记录:图实验讨论:1、从表格中可以看出,测定管上清液点样出现了两个色斑,根据Rf值的计算也可以看出,测定管中氨基酸发生了转氨基作用,生成的未知物质b为谷氨酸,则未知溶质a为丙氨酸;对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应,只有丙氨酸,所以色斑只有一个。2、 层析点样时手要洗净,操作中尽可能少量接触滤纸,以免污染。3、 层析液中含有腐蚀性酚,取用时注意安全,防止溅到皮肤及眼睛。4、点样点不宜过大,直径小于XX年9月19日实验报告课程名称:生化实验甲指导老师:成绩: 实验名称:氨基移换反应及其产物的鉴定实验类型:同组学生姓名:一、实验目的和要求二、实验内容和原理三、实验材料与试剂四、实验器材与仪器五、操作方法和实验步骤六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析八、讨论、心得一、 实验目的和要求1、学****鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理;2、学****纸层析的原理和操作技术