决明子胰蛋白酶抑制剂coti的分离纯化及性质研究.docx

决明子胰蛋白酶抑制剂coti的分离纯化及性质研究.docx生物化学与分子生物学专业优秀论文决明子胰蛋白酶抑制剂COTI
的分离纯化及性质研究
关键词：决明子胰蛋白酶抑制剂免疫印迹菜青虫COTI分离纯化
摘要：天然的蛋白酶抑制剂是一类分子量较小，稳定性好，对蛋白酶活性有抑制 作用的蛋白质或多肽及油菜叶(经含COTI缓冲液浸泡过)饲喂菜青虫实验，引起菜青虫体重 明显下降，并导致其部分死亡的结果显示，说明COTI对菜青虫生长具有明显的 抑制作用，为进一步研究植物蛋白酶抑制剂抗虫、抗病等生理活动提供新的参考 价值和基础依据。
天然的蛋白酶抑制剂是一类分子量较小，稳定性好，对蛋白酶活性有抑制作用的 蛋白质或多肽，广泛存在于动物、植物及微生物中，尤其在植物贮存器官种子中， 蛋白酶抑制剂含量常高达总蛋白的10%。它以类似底物形式与蛋白酶活性部位 或变构部位结合，形成稳定的酶-抑制剂复合物，调节生物体内蛋白酶活性，阻 止不良的蛋白水解。植物蛋白酶抑制剂已成为研究与蛋白代谢相关的医药及生物 学的强有力的工具，在植物抗虫基因工程及疾病控制方面占有十分突出的地位。 本论文从决明种子中分离纯化得到胰蛋白酶抑制剂COTI (Cassia obtusifolia L. seeds trypsin inhibitor),并对其进行了部分性质研究。 豆科植物决明
(Cassia obtusifolia L.)的成熟种子，研磨粉碎后经水两次抽提，65°C热变性, 35%〜65%硫酸铉分部盐析等步骤，得到抑制剂粗提物。 进一步利用
trypsin-sepharose-4B亲和层析和Sephadex G-75凝胶过滤，最后从粗提液中 分离纯化得到其中具有活性的胰蛋白酶抑制剂(COTI), SDS-PAGE检测显示为一 条多肽链，其近似分子量为19KD：热稳定性实验显示COTI在100°C水浴条件 80min后仍可以保持部分的抑制活性，具有极局的热稳定性。变性剂二硫苏糖醇 (DTT)37°C处理120min后，COTI仍具有约50%的活性，COTI存在活性下降的现 象说明了二硫键对于维系COTI的活性中心起到了很重要的作用，但COTI仍保留
了部分活性，是一种稳定性好的蛋白酶抑制剂。 抑制动力学实验证明：COTI
抑制类型为竞争性抑制，抑制常数Ki测得为
5. 091 X lO& It ;& #39; -8& gt ;mol/L。 将纯化的 COTI 对新西兰雄 兔进行多次免疫制备出免疫特异性强、效价高的抗血清。双向免疫扩散呈现一条 清晰的沉淀线，确定抗血清效价为1： 64,免疫印迹实验表明纯化的胰蛋白酶抑 制剂免疫杂交带在19KD处。 COTI对菜青虫幼虫肠道提取物胰蛋白酶活性抑 制实验，及油菜叶(经含COTI缓冲液浸泡过)饲喂菜青虫实验，引起菜青虫体重 明显下降，并导致其部分死亡的结果显示，说明COTI对菜青虫生长具有明显的 抑制作用，为进一步研究植物蛋白酶抑制剂抗虫、抗病等生理活动提供新的参考 价值和基础依据。
天然的蛋白酶抑制剂是一类分子量较小，稳定性好，对蛋白酶活性有抑制作用的 蛋白质或多肽，广泛存在于动物、植物及微生物中，尤其在植物贮存器官种子中， 蛋白酶抑制剂含量常高达总蛋白的10%。它以类似底物形式与蛋白酶活性部位 或变构部位结合，形成稳定的酶-抑制剂复合物，调节生物体内蛋白酶活性，阻 止不良的蛋白水解。植物蛋白酶抑制剂已成为研究与蛋白代谢相关的医药及生物 学的强有力的工具，在植物抗虫基因工程及疾病控制方面占有十分突出的地位。 本论文从决明种子中分离纯化得到胰蛋白酶抑制剂COTI (Cassia obtusifolia L. seeds trypsin inhibitor),并对其进行了部分性质研究。 豆科植物决明
(Cassia obtusifolia L.)的成熟种子，研磨粉碎后经水两次抽提，65°C热变性, 35%〜65%硫酸铉分部盐析等步骤，得到抑制剂粗提物。 进一步利用
trypsin-sepharose-4B亲和层析和Sephadex G-75凝胶过滤，最后从粗提液中 分离纯化得到其中具有活性的胰蛋白酶抑制剂(COTI), SDS-PAGE检测显示为一 条多肽链，其近似分子量为19KD：热稳定性实验显示COTI在100°C水浴条件 80min后仍可以保持部分的抑制活性，具有极局的热稳定性。变性剂二硫苏糖醇 (DTT)37°C处理120min后，COTI仍具有约50%的活性，COTI存在活性下降的现 象说明了二硫键对于维系COTI的活性中心起到了很重要的作用，但COTI仍保留 了部分活性，是一种稳定性好的蛋白酶抑制剂。 抑制动力学实验证明：COTI
抑制类型为竞争性抑制，抑制常数Ki测得为
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